蛋白酶K的應(yīng)用技術(shù)

　  蛋白酶k是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到。該酶有兩個(gè)ca2+結(jié)合位點(diǎn)，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機(jī)理并無直接關(guān)系。然而，如果從該酶中除去ca2+，由于出現(xiàn)遠(yuǎn)程的結(jié)構(gòu)變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染酸制品的蛋白質(zhì)。所以，蛋白酶k消化過程中通常加入edta（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對(duì)蛋白酶k具有較強(qiáng)耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l ca2+而不含edta的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l,以鰲合ca2+。

　　蛋白酶K，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性。

　　推薦反應(yīng)緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。

　　值得注意的是，蛋白酶K在原位雜交技術(shù)中通常用于雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質(zhì)的作用,以增加探針與靶核酸結(jié)合的機(jī)會(huì),提高雜交信號(hào).但蛋白酶K的濃度過高、消化時(shí)間過長(zhǎng)或孵育溫度過高時(shí),都會(huì)對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)有一定的破壞,導(dǎo)致組織切片的脫落,細(xì)胞核的消失,從而影響雜交結(jié)果.EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現(xiàn)的問題,并能達(dá)到理想的染色效果.

　　保存：保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融，有效保證12月

　　孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時(shí)間為15分鐘至48小時(shí)；理想孵育時(shí)間為2小時(shí)